Publicerat 5.9.2024
Text: Tiina Sävilammi
Bild: Shutterstock
Redigering: Viestintätoimisto Jokiranta Oy

 

Den nya generationens metoder för massekvensering har under de senaste decennierna gjort det möjligt att samla in omfattande medicinska och biologiska forskningsdata. Så kallade metagenomiska metoder gör det möjligt att noggrant kartlägga arterna i hela organismsamhällen i alla slags ekosystem.

Kartläggningen av arter i mikrobsamhällen har öppnat nya möjligheter att observera både mikrobernas inbördes växelverkan och deras växelverkan med miljön och värdorganismerna. Genom en bättre förståelse av mikrobernas mångfald och hur den påverkar miljön kan informationen utnyttjas också till exempel inom medicin vid planeringen av framtidens behandlingar.

Genom sekvensering av hela genom kan man vid identifieringen av arter redan uppnå en sådan exakthet att arterna kan särskiljas från varandra. Genom att jämföra generna i olika organismsamhällens metagenom kan man också undersöka funktionella skillnader mellan organismsamhällena, såsom förekomsten av antibiotikaresistensgener eller mängden bakterier i marken som deltar i kolbindningen. Dessutom är det möjligt att undersöka sammansättningen av en individs mikrobiom som en indikator på sjukdomar eller att observera exempelvis mängden bakterier i tarmmikrobiomet som bryter ner vissa näringsämnen. Forskningen bromsas dock av att de omfattande DNA-sekvenseringar som de nya metoderna kräver för närvarande är relativt dyra.

 

Mot snabbare, enklare och förmånligare sekvensering

För DNA-sekvensering har det utvecklats ett flertal olika anordningar, rättare sagt plattformar, med något olika arbetsmoment och reaktionsserier. Ett gemensamt problem är fortfarande den arbetskrävande förbehandlingen av DNA före själva sekvenseringen. Provet förbehandlas i ett laboratorium så att det bildar molekyler som kan avläsas av sekvenseringsapparaten – med andra ord skapar man ett så kallat DNA-sekvenseringsbibliotek av provet. I regel innebär skapandet av ett bibliotek först att DNA från hela genom spjälkas till en fragmentlängd som lämpar sig för varje plattform, varefter DNA-adaptrar som är kompatibla med apparaten i fråga fästs i ändarna på fragmenten.

Vissa virus använder sig av DNA-transposition, eller så kallade hoppande gener, när de fortplantar sig. I denna process kopplar virusen sina egna genom till värdorganismens DNA med hjälp av hoppande gener. Vid Åbo universitet pågår ett projekt där vi utvecklar och utnyttjar en ny typ av metod som baserar sig på transpositionsmekanismen i bakteriofag mu. Syftet är att påskynda och underlätta framställningen av sekvenseringsbibliotek och samtidigt sänka kostnaderna. Metoden gör det möjligt att minska arbetsmomenten och att sekvenseringsbibliotek kan konstrueras också för långa avläsningssekvenser, upp till 50 000 nukleotider.  

I fallstudien tillämpar vi den här optimerade metoden. Vi utnyttjar massekvensering när vi undersöker sambandet mellan hästars tarmflora och kronisk tarminflammation (IBD).

 

IBD hos hästar kan identifieras med hjälp av massekvensering

IBD hos både människor och hästar har under de senaste åren i allt högre grad identifierats som en grupp sjukdomar som verkar har blivit vanligare i människopåverkade miljöer. Man vet ännu inte exakt vilka olika former av IBD som drabbar hästar, hur ofta de förekommer och vilka faktorer som påverkar deras uppkomst.

Hos hästar är symptomen sällan i första hand relaterade till magbesvär, utan de kan omfatta beteendeproblem och nedsatt prestationsförmåga och leda till alltför tidig pensionering. Det är svårt att ställa en diagnos, eftersom hästen måste fasta, transporteras till en klinik och sederas inför en endoskopi. Diagnosen har också en stor felmarginal, eftersom den ofta baserar sig på en allmän symptombild – största delen av tarmsystemet kan inte undersökas av praktiska orsaker. Överlevnadsprognosen för IBD är trots framstegen i de senaste årens forskning fortfarande bara medelgod.

I undersökningar av andra däggdjur har man upptäckt att organismsammansättningen i tarmfloran är en lovande biomarkör för IBD. Sambandet mellan tarmflorans sammansättning och IBD har nyligen utretts i vår pilotstudie som referentgranskats vid Jyväskylä universitet. Vi använde tarmmikrober från friska och IBD-sjuka hästar och tränade en maskininlärningsmodell att identifiera individer med IBD utifrån dem. Modellen lyckades noggrant förutspå hälsostatusen hos på förhand okända hästindivider. Trots ett begränsat antal prover i pilotstudien visar resultaten att kartläggning av tarmfloran har potential att bli en praktisk indikator för IBD.

I pilotstudien använde vi en metod för sekvensering av en subenhet av mitokondriellt DNA för identifiering av mikrober. Fördelen med metoden är att den är billig. Problemet är dock att den markörsekvens som används är kort – med hjälp av den kan man inte identifiera bakterier ända ner på art- eller stamnivå. Forskning på stamnivå skulle ändå vara av största vikt, eftersom bakterier är ytterst mångformiga. Inom samma art förekommer ofta både arter som är viktiga för värdorganismens hälsa och patogena arter.

I vårt projekt, som bygger på transpositionsbaserade sekvenseringsbibliotek, demonstrerar vi effekten av den nya metoden genom att sekvensera hela metagenom av tarmmikrober. Vårt material kommer också att omfatta svampar och DNA-virus. På så sätt kan vi göra observationer av olika mikrobgruppers relativa andelar och funktionen hos olika mikrobarter, till exempel förekomsten av antibiotikaresistenta bakteriestammar hos finländska hästar.

 

Ny kunskap på molekylär nivå

Artbeståndet i ett mikrobiellt ekosystem är relativt enkelt att kartlägga och det kan också manipuleras utifrån kartläggningen. Metoder som baserar sig på kartläggning av mikrober i tarmsystemet och andra vävnader förväntas i framtiden ha betydande tillämpningar också inom humanmedicinen.

I den nya teknik som vi utvecklar ingår också identifiering av enskilda ringformade DNA-molekyler i metagenomdata. Denna helt nya tillämpning kommer att ge en ny typ av molekylär kunskap om omvärlden. Den kan visa sig vara särskilt användbar också inom cancerdiagnostiken, eftersom färska forskningsrön visar att det finns olika ringlika strukturer i cancercellers DNA.

 

 

 

 

FD Tiina Sävilammi arbetar vid institutionen för biologi vid Åbo universitet. Sävilammi har under sin karriär arbetat med ett flertal projekt vid Åbo och Jyväskylä universitet om genomik i naturliga populationer och disputerade 2024 om hur laxen anpassar sig på molekylnivå till miljöförändringar. För närvarande bedriver hon med stöd från Sakari Alhopuros stiftelse forskning som effektiviserar skapandet av DNA-bibliotek genom att utnyttja transpositionsmekanismen i virus. Sävilammi är intresserad av praktiska tillämpningar av sekvensering, såsom användning av tarmfloran hos hästar som en potentiell indikator för kronisk tarminflammation.

 

 

 

Litteratur

Savilahti, H., Rice, P. A., & Mizuuchi, K. (1995). The phage Mu transpososome core: DNA requirements for assembly and function. EMBO Journal, 19: 4893–4903.

Sävilammi, T., Alakangas, R.-R., Häyrynen, T., & Uusi-Heikkilä, S. (2024). Gut Microbiota Profiling as a Promising Tool to Detect Equine Inflammatory Bowel Disease (IBD). Animals, 14(16), Article 2396.