Julkaistu 5.9.2024
Teksti: Tiina Sävilammi
Kuva: Shutterstock
Toimitustyö: Viestintätoimisto Jokiranta Oy

 

Uuden sukupolven massasekvensointimenetelmät ovat viime vuosikymmeninä tehneet mahdolliseksi laajamittaisen lääketieteellisen ja biologisen tutkimustiedon kerryttämisen. Niin kutsutut metagenomiikkamenetelmät mahdollistavat kokonaisten eliöyhteisöjen lajistojen tarkan kartoittamisen kaikenlaisissa ekosysteemeissä.

Mikrobiyhteisöjen lajistojen kartoitus on avannut uudenlaisia mahdollisuuksia havainnoida sekä mikrobien keskinäisiä vuorovaikutuksia että niiden vuorovaikutuksia ympäristön ja isäntäeliöiden kanssa. Kun mikrobien monimuotoisuutta ja sen vaikutuksia ympäristöön ymmärretään paremmin, voidaan tietoa hyödyntää myös esimerkiksi lääketieteessä tulevaisuuden hoitoja suunniteltaessa.

Kokonaisia genomeja sekvensoimalla päästään lajintunnistuksessa jo sellaiseen tarkkuuteen, että eliölajit voidaan erottaa toisistaan. Vertailemalla eri eliöyhteisöjen metagenomien sisältämiä geenejä voidaan myös tutkia eliöyhteisöjen toiminnallisia eroja, kuten antibioottiresistenssigeenien esiintyvyyttä tai hiilensidontaan osallistuvien bakteerien määrää maaperässä. Lisäksi on mahdollista tutkia yksilön mikrobiston koostumusta sairauksien indikaattorina tai havainnoida esimerkiksi tiettyjä ravintoaineita hajottavien bakteerien määrää suolistomikrobistossa. Tutkimusta jarruttaa kuitenkin se, että uusien menetelmien vaatimat laajamittaiset DNA-sekvensoinnit ovat tällä hetkellä suhteellisen kalliita.

Kohti nopeampaa, helpompaa ja edullisempaa sekvensointia

DNA-sekvensointia varten on kehitetty lukuisia eri laitteistoja eli alustoja, joihin liittyy yksityiskohdiltaan hieman eroavia työvaiheita ja reaktiosarjoja. Yhteisenä ongelmana on edelleen DNA:n työläs esikäsittely ennen varsinaista sekvensointia. Näyte esikäsitellään laboratoriossa niin, että siitä muodostuu sekvensointilaitteen luettavissa olevia molekyylejä – eli näytteestä luodaan niin kutsuttu DNA:n sekvensointikirjasto. Tyypillisesti kirjaston tekoon sisältyy ensin kokonaisten genomien DNA:n pilkkominen kullekin alustalle sopivaan fragmenttipituuteen, minkä jälkeen fragmenttien päihin kiinnitetään kunkin laitteen kanssa yhteensopivat DNA-adapterit.

Tietyt virukset käyttävät DNA:n transpositiota eli niin sanottua geenihyppyä lisääntymisessään. Tässä prosessissa virukset liittävät oman genominsa isäntäeliön DNA:han käyttäen geenihypyn koneistoa. Turun yliopistossa aloitetussa projektissa kehitämme ja hyödynnämme Mu-bakteriofagin transpositiokoneiston toimintaan pohjautuvaa uudentyyppistä menetelmää, jonka tarkoituksena on nopeuttaa ja helpottaa sekvensointikirjastojen tekoa sekä alentaa sen kustannuksia. Sovellus mahdollistaa työvaiheiden vähentämisen ja sen, että sekvensointikirjastoja voidaan tehdä myös pitkiä lukupitoisuuksia varten, aina 50 000 nukleotidiin asti.   

Sovellamme tätä optimoimaamme menetelmää tapaustutkimuksessa. Hyödynnämme massasekvensoinnin voimaa tutkiessamme hevosen suolistomikrobiston ja kroonisen suolistotulehduksen (IBD) yhteyttä.

Massiivisekvensoinnin avulla hevosen IBD:n jäljille

Sekä ihmisen että hevosen IBD on viime vuosina yhä enenevässä määrin tunnistettu joukko sairauksia, jotka vaikuttavat yleistyneen ihmisen muokkaamassa ympäristössä. Vielä ei tarkkaan tiedetä, mitä hevosen eri IBD:n muotoja on olemassa, mikä on niiden esiintyvyys ja mitkä tekijät vaikuttavat niiden syntyyn.

Hevosella oireet eivät useinkaan liity ensisijaisesti vatsavaivoihin, vaan ne voivat käsittää käytösongelmia ja suorituskyvyn laskua ja johtaa usein hevosen ennenaikaiseen eläköitymiseen. Diagnoosin teko on hankalaa, koska hevonen pitää paastottaa, kuljettaa klinikalle ja rauhoittaa tähystystä varten. Diagnoosi sisältää myös suuren virhemarginaalin, sillä se perustuu usein yleiseen oirekuvaan – suurinta osaa suolistosta ei voida tutkia käytännön syistä. Selviämisennuste IBD:stä on viime vuosien tutkimusten tuomista edistysaskelista huolimatta edelleen keskinkertainen.

Muilla nisäkkäillä tehdyissä tutkimuksissa on huomattu, että suolistomikrobiston eliöyhteisön koostumus on lupaava IBD:n biomarkkeri. Suolistomikrobiston koostumuksen ja IBD:n yhteyttä on hiljattain selvitetty Jyväskylän yliopistossa valmistuneessa, vertaisarvioidussa pilottitutkimuksessamme. Käytimme siinä terveiden ja IBD:tä sairastavien hevosten suolistomikrobistoja ja opetimme koneoppimismallin tunnistamaan niiden perusteella IBD:tä sairastavat yksilöt. Malli onnistui ennustamaan tarkasti ennalta tuntemattomien hevosyksilöiden terveysstatukset. Vaikka näytemäärä oli pilottitutkimuksessa rajallinen, tulokset osoittavat, että suolistomikrobiston kartoituksessa on potentiaalia käytännön IBD-indikaattoriksi.

Pilottitutkimuksessa käytimme mikrobien tunnistukseen DNA:n mitokondrion alayksikön sekvensointimenetelmää, jonka etuna on edullisuus. Ongelmana on kuitenkin käytettävän markkerisekvenssin lyhyys – sen avulla ei voida tunnistaa bakteereja laji- tai kantatasolle asti. Kantatason tutkimus olisi kuitenkin ensiarvoisen tärkeää, sillä bakteerit ovat hyvin monimuotoisia. Saman lajin sisällä esiintyy usein sekä isäntäeliön hyvinvoinnille tärkeitä että patogeenisiä lajeja.

Transpositiopohjaiseen sekvensointikirjastojen tekoon perustuvassa projektissamme demonstroimme uuden menetelmän tehoa sekvensoimalla kokonaiset suolistomikrobistojen metagenomit. Aineistomme tulee kattamaan myös sienet ja DNA-virukset. Näin voimme päästä tekemään havaintoja eri mikrobiryhmien suhteellisista osuuksista sekä mikrobilajistojen toiminnallisuudesta, esimerkiksi suomalaisissakin hevosissa esiintyvien antibioottiresistenttien bakteerikantojen esiintyvyydestä.

Uutta molekyylitason tietoa

Mikrobiekosysteemin lajisto on suhteellisen helppo kartoittaa, ja sitä voidaan myös manipuloida kartoitusten pohjalta. Suoliston ja muiden kudosten mikrobistokartoituksiin perustuvilla menetelmillä odotetaankin olevan merkittäviä sovelluksia tulevaisuudessa myös ihmislääketieteen saralla.

Kehittämäämme uuteen teknologiaan sisältyy myös yksittäisten rengasmaisten DNA-molekyylien tunnistaminen metagenomidatasta. Tämä täysin uusi sovellus tulee antamaan uudenlaista molekyylitason tietoa ympäröivästä maailmasta. Se voi osoittautua erityisen käyttökelpoiseksi myös syöpädiagnostiikassa, sillä aivan uusimpien tutkimusten mukaan syöpäsolujen DNA:sta löydetään erilaisia rengasmaisia rakenteita.

 

 

 

FT Tiina Sävilammi työskentelee Turun yliopistossa biologian laitoksella. Sävilammi on työskennellyt uransa aikana lukuisissa luonnonpopulaatioiden genomiikkaprojekteissa Turun ja Jyväskylän yliopistoissa, ja hän väitteli vuonna 2024 lohikalan molekyylitason sopeutumisprosessista ympäristönmuutokseen. Tällä hetkellä hän tekee Sakari Alhopuron säätiön tukemaa tutkimusta, jossa tehostetaan DNA-kirjastojen tekoa virusten transpositiokoneistoa hyödyntäen. Sävilammia kiinnostavat sekvensoinnin käytännön sovellukset, kuten hevosten suolistomikrobiston käyttöarvo kroonisen suolistotulehduksen indikaattorina.

 

 

 

 

 

Kirjallisuutta

Savilahti, H., Rice, P. A., & Mizuuchi, K. (1995). The phage Mu transpososome core: DNA requirements for assembly and function. EMBO Journal, 19: 4893-4903.

Sävilammi, T., Alakangas, R.-R., Häyrynen, T., & Uusi-Heikkilä, S. (2024). Gut Microbiota Profiling as a Promising Tool to Detect Equine Inflammatory Bowel Disease (IBD). Animals, 14(16), Article 2396.